BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI AVANZATE

La produzione delle proteine ricombinanti, un metodo centrale nelle Biotecnologie molecolari.

Produzione di proteine in E. coli. Espressione di geni eterologhi.

Vettori di espressione batterici – importanza dei promotori impiegati - organizzazione degli elementi funzionali del vettore.

Produzione massiva di proteine – sistemi di purificazione – proteine di fusione e con tag -  ospiti batterici.

Il clonaggio, la tecnica fondamentale per l’ingegneria genetica. Metodi di clonaggio avanzato.

Clonaggio convenzionale restrizione/ligazione. - Clonaggio con enzimi di restrizione di tipo IIs. Sistema di clonaggio e assemblaggio Golden Gate. - Clonaggio di frammenti di PCR. Sistema TOPO1-TA.-  Clonaggio indipendente dalla ligazione (LIC). -  Clonaggio indipendente dalla sequenza e dalla ligazione (SLIC).  -  Clonaggio basato sulla ricombinazione. Sistema Gateway.  -  Clonaggio ordinato di frammenti multipli.  -  Metodi di clonaggio basati su reazioni di PCR.  -  Mutagenesi basata su tecniche di clonaggio.

Produzione di proteine in cellule eucariotiche. -  Pro- e cons- della produzione di proteine in cellule eucariotiche. -  Lieviti come sistemi di produzione di proteine.  - Vettori di integrazione e di replicazione - cellule ospiti – metodi di coltura – vettori shuttle.  - Sistema di espressione in baculovirus.

Clonaggio in cellule di mammifero.  -  Clonaggio senza vettore.  -  Colture primarie e secondarie.  -  Vettori di espressione in cellule eucariotiche – metodi di trasferimento di acidi nucleici – liposomi.

La produzione di proteine ricombinanti terapeutiche in cellule eucariotiche in coltura – i Bioreattori.  - Ingegnerizzazione dell’ospite e dei vettori e massimizzazione della produttività delle cellule.  -  Metodi di coltura.

Proteine di origine biotecnologica usate in terapia.

Scoperta, metodi di produzione e funzione delle seguenti classi di proteine. - Enzimi terapeutici - Fattori della coagulazione (Factor VIII and Factor IX) -Agenti trombolitici (tpa, streptokinasi- altri enzimi. - Ormoni ed immunomodulatori - insulina, glucagone, ormone della crescita - Interferoni ed interleukine

La risposta immunitaria e le molecole biotecnologiche ad essa associate.

Immunità umorale e cellulare. - Immunoglobuline – anticorpi poli- e monoclonali. - Produzione di anticorpi monoclonali: dal metodo dell’ibridoma alla sintesi biomolecolare. MAb umani o umanizzati – librerie combinatoriali – derivati ingegnerizzati degli anticorpi

Vaccini – sistemi di scelta e produzione degli antigeni necessari per l’immunizzazione – vaccini anti-HIV, anti-influenzali – sviluppo e produzione dei vaccini anti-Covid 19 – vaccini a RNA.

Prodotti biotecnologici per Terapie Avanzate (Advanced Therapy Medicinal Products, ATMP) - Terapie geniche ex-vivo (CAR T Therapy, etc) - Vettori virali sviluppo e struttura e utilizzo nelle terapie geniche - Terapie geniche in-vivo – riparazione delle mutazioni con sistemi biotecnologici.

Farmaci a RNA – RNA codificanti proteine – RNA non codificanti: oligonucleotidi antisenso (ASO), RNA interferenti, aptameri – meccanismi di azione -  modificazioni chimiche – Tecnologia SELEX – sistemi di trasporto dei farmaci a RNA

Brevettazione e protezione della. proprietà intellettuale: pro e contro – studi preclinici e clinical trials.

Appunti di lezione. Le presentazioni  saranno caricate su Studium. Articoli mongrafici o review verranno anche forniti per permettere  a  studenti o gruppi di studenti, di approfondire singole tematiche.

Per argomenti di base si utilizzi il testo: T:A. Brown, Biotecnologie molecolari, 3za ed. Zanichelli 2022. 

Per la sintesi dei farmaci biotecnologici si consiglia: Vegeto, Maggi, Minghetti, Farmaci Biotecnologici, CEA

Non esiste un libro unico per i contenuti di questo corso per cui è inidispensabile la frequenza e lo studio del materiale bibliografico fornito.